|
" خالص سازي و تعيين خصوصيات آلفا توکسين کلستريديم پرفرژنجنس تيپ A "
مجيدي، بهجت
| شماره شناسایی
|
:
|
18885630
|
| شماره مدرک
|
:
|
۶۷۹۴۹
|
| نام عام مواد
|
:
|
[گزارش نهایی -عادی]
|
| شناسه افزوده
|
:
|
مجيدي، بهجت
|
|
|
:
|
مهرورز، محسن
|
| عنوان اصلي
|
:
|
خالص سازي و تعيين خصوصيات آلفا توکسين کلستريديم پرفرژنجنس تيپ A
|
| نام نخستين پديدآور
|
:
|
مجيدي، بهجت
|
| عنوان اصلي به زبان ديگر
|
:
|
Purification and characterization of alpha-toxin from Clostridium perfringens type A
|
| وضعیت انتشار
|
:
|
کرج: موسسه تحقيقات واکسن وسرم سازي رازي، ۱۴۰۴
|
| فروست
|
:
|
شماره ثبت ۶۷۹۴۹ مورخ ۱۴۰۴/۰۶/۱۷۶۷۹۴۹
|
|
|
:
|
شماره طرح : 2-82-18-114-990727
|
|
|
:
|
سامانه سمپات
|
| توصیفگر
|
:
|
clostridium p[erfringens type A
|
|
|
:
|
توکسین آلفا
|
|
|
:
|
آنزیم
|
|
|
:
|
بهینه سازی
|
|
|
:
|
کروماتوگرافی
|
| خلاصه یا چکیده
|
:
|
کلستریدیوم پرفرژنس یک باکتری گرم مثبت، میله ای بی هوازی و اسپورزا است که قادر به تولید اگزوتوکسین های مختلف باکتریایی است. توکسین آلفا از کلستریدیوم پرفرژنس تیپ A تولید می شود ، یک متالوفسفولیپاز است که سبب مسمومیت غذایی می شود و مشخصه آن اسهال و ناراحتی شکمی یا حتی مرگ است. مواد و روش ها: در ابتدا جهت شناسایی بهتر باکتری ، از توالی مربوط به ژن آلفا توکسین و توالی 16srRNA طراحی پرایمر صورت گرفت و پس از توالی یابی ، توالی های مورد نظر با استفاده از پایگاه های داده جهانی بلاست و الاینمنت انجام شد و توالی با توالی کلستریدیوم پرفرنژنس تیپ A تطبیق داده شد. جهت بهینه سازی شرایط رشد و حصول حداکثر توکسین توسط باکتری مورد استفاده در پروژه حاضر، در ابتدا منابع نیتروژن، کربن ، مواد معدنی و ویتامین ها مورد بررسی قرار گرفته و بهینه سازی شدند. در طول این فرایند، از روش تست لسیتیناز و همولیزین ، جهت کنترل تولید توکسین استفاده گردید. از کشت بهینه در حجم بالاتر جهت تخلیص توکسین آلفا استفاده گردید و در این فرایند از تکنیک های سالتینگ اوت، و روش های کروماتوگرافی استفاده گردید. تعیین کیفیت و کمیت توکسین با استفاده از روش های جذب نوری، تست همولیزین و الکتروفورز عمودی انجام شد. روش زایموگرافی جهت تکمیل بررسی کیفی توکسین از لحاظ ساختاری و اندازه و محل حضور استفاده گردید . همچنین، پس از تخلیص توکسین و تایید خلوص، توکسین خالص به خرگوش به عنوان حیوان مدل آزمایشگاهی تزریق گردید و آنتی بادی علیه توکسین خالص تهیه گردید . از روش های وسترن بلات جهت تعیین کیفیت و اختصاصیت اتصال و الیزا جهت تعیین تیتر و اختصاصیت اتصال استفاده گردید.
محیط انتخاب شده با بیشترین عملکرد تولید توکسین شامل 0.5٪ منبع کربن ، 4٪ منبع نیتروژن ، و 0.25٪ بافر فسفات است. بیشترین فعالیت آنزیم در حضور روی و منیزیم به عنوان منابع فلزی بود. نتایج SDS.PAGE نشان داده شد که آنزیم با موفقیت به عنوان یک باند واحد با وزن مولکولی تخمینی 43 کیلو دالتون خالص شد: بر اساس نتایج ، محیط کشت بهینه شده و شرایط رشد برای تولید توکسین آلفا برای تولید واکسن قابل استفاده بود. همچنین ، توکسین خالص می تواند در کاربردهای تشخیصی و تحقیقات واکسن مورد استفاده قرار گیرد. باند آنتی توکسین آلفا جدا شده توسط الکتروفورز( وزن مولکولی 43 کیلو دالتون توکسین آلفا) از طریق وسترن بلات بدون هیچ گونه واکنشی به پروتئین های دیگر در کاغذ نیتروسلولز واکنش نشان دادند.در نهایت نتایج الیزا نشان داد که آنتی بادی تولید شده با تکرارپذیری بالا و اختصاصیت بالا تا تیتر 8000/1 قادر به شناسایی توکسین می باشد.
|
|
|
:
|
Clostridium perfringens is a Gram-positive, anaerobic, spore-forming rod capable of producing various bacterial exotoxins. Produced by Clostridium perfringens type A, alpha toxin is a metallophospholipase that causes food poisoning characterized by diarrhea and abdominal discomfort or even death. Materials and methods: First, in order to better identify the bacteria, primers were designed from the alpha toxin gene sequence and the 16srRNA sequence, and after sequencing, the desired sequences were performed using global blast and alignment databases, and the sequence It was adapted to the sequence of Clostridium perfringens type A. In order to optimize the growth conditions and obtain the maximum toxin by the bacteria used in the present project, at first the sources of nitrogen, carbon, minerals and vitamins were investigated and optimized. During this process, lecithinase and hemolysin test methods were used to control toxin production. Optimum culture in higher volume was used to purify alpha toxin and salting out techniques and chromatography methods were used in this process. Determining the quality and quantity of toxin was done using optical absorption methods, hemolysin test and vertical electrophoresis. Zymography method was used to complete the qualitative investigation of the toxin in terms of structure, size and location. Also, after purifying the toxin and confirming its purity, the pure toxin was injected into a rabbit as a laboratory model animal, and an antibody against the pure toxin was prepared. Western blot methods were used to determine the quality and specificity of binding and ELISA to determine the titer and specificity of binding.
The selected medium with the highest toxin production performance includes 0.5% carbon source, 4% nitrogen source, and 0.25% phosphate buffer. The highest enzyme activity was in the presence of zinc and magnesium as metal sources. The results of SDS.PAGE showed that the enzyme was successfully purified as a single band with an estimated molecular weight of 43 kDa: based on the results, the optimized culture medium and growth conditions for alpha toxin production could be used for vaccine production. Also, purified toxin can be used in diagnostic applications and vaccine research. The alpha antitoxin band separated by electrophoresis (molecular weight of alpha toxin 43 kDa) reacted through western blotting without any reaction to other proteins in nitrocellulose paper. Finally, the ELISA results showed that the antibody produced with high reproducibility And high specificity up to 1/8000 titer is able to identify the toxin.
|
| |