|
" بهينه سازي کشت باکتري ترانسفورم حاوي ژن کد کننده توکسين نوترکيبب AnCra1 در شرايط فرمانتوري "
زارع ميرک آبادي، عباس
| شماره شناسایی
|
:
|
18886209
|
| شماره مدرک
|
:
|
۶۸۱۷۶
|
| نام عام مواد
|
:
|
[گزارش نهایی -عادی]
|
| شناسه افزوده
|
:
|
زارع ميرک آبادي، عباس
|
|
|
:
|
بيات زاده، محمد علي
|
|
|
:
|
محمدپوردونيقي، ناصر
|
|
|
:
|
ذوالفقاريان، حسين
|
| عنوان اصلي
|
:
|
بهينه سازي کشت باکتري ترانسفورم حاوي ژن کد کننده توکسين نوترکيبب AnCra1 در شرايط فرمانتوري
|
| نام نخستين پديدآور
|
:
|
زارع ميرک آبادي، عباس
|
| عنوان اصلي به زبان ديگر
|
:
|
Optimization of culture condition for the bacterial recombinant Ancra1 toxin in bioreactor
|
| وضعیت انتشار
|
:
|
کرج: موسسه تحقيقات واکسن وسرم سازي رازي، ۱۴۰۴
|
| فروست
|
:
|
شماره ثبت ۶۸۱۷۶ مورخ ۱۴۰۴/۰۷/۲۹۶۸۱۷۶
|
|
|
:
|
شماره طرح : 12-18-18-017-01018-010398
|
|
|
:
|
سامانه سمپات
|
| توصیفگر
|
:
|
عقرب
|
|
|
:
|
Androctonus crassicauda
|
|
|
:
|
، نوروتوکسین
|
|
|
:
|
کشت فرمانتوری
|
|
|
:
|
بیان ژن
|
| خلاصه یا چکیده
|
:
|
سموم عقرب ها مجموعه ای پیچیده از اجزاء فعال زیستی است که با تاثیر بر کانالهای یونی به عنوان مهمترین ناحیه هدف، عملکرد دارند. عقرب های خطرناک دارای سم α با پپتیدهایی زنجیر بلند و چهار پل دی سولفیدی موثر بر کانالهای سدیم می باشند. برمبنای اهمیت کلینیکی و پزشکی سم عقرب A. crassicauda در ایران در این مطالعه و در ادامه مطالعه پیشین پس از بهینه سازی سازه ژنی و نیز بهینه سازی بیان ژن پپتید توکسیک AnCra1، در سیستم وکتوری pET22b با سویه باکتری پذیرا E.Coli RG2 فرایند کلونسازی و بیان ژن نوترکیب با شرایط بهبود یافته انجام شد. در ادامه پروژه اول پس از تایید صحت سازه ژنی و کلون سازی صحیح آن در باکتری پذیرا و تایید باکتری ترانسفورم شده حاوی ژن کد کننده توکسین نو ترکیب نسبت به کشت در شرایط فرمانتور و بهینه سازی آن اقدام شد: ابتدا با توجه به شرایط فرمانتور در دسترس : حجم، شرایط اکسیژن دهی، ویژگیهای PH ، دما ، نوع همزن و دور همزن بهینه شد. سپس نسبت به انتخاب سویه باکتری با قابلیت بیان حداکثری در شرایط فرمانتور : باکتری E.Coli سویه های RGb, با توجه به قابلیتهای آن اقدام شد و در ادامه نسبت به انتخاب محیط کشت باکتری به صورت تجاری و دست ساز آزمایشگاهی اقدام شد و در انتها با بهینه سازی شرایط بیان ژن در فرمانتور به نسبت زمان ، میزان و نوع القاء کننده بیان ژن اقدام گردید. در نهایت بهترین شرایط کشتی از نظر میزان CFU و بهینه سازی کشت باکتری در شرایط دما:35.5 درجه- pH:6.8-اکسیژن رسانی :0/7 بار-دور همزن:250rpm- دو خروجی هوا با flow 0/2- و میزان 5درصد گلوکز اضافی بر محیط کشت LB براث (K2HPO4:12.5g/l, KH2PO4: 2.3g/l, yeast extract: 20g/l, trypton 10g/l, ) جهت کشت باکتری ترانسفورم شده E.Coli RG2 به مدت 3 ساعت و پس از رسیدن OD محیط به 0/8 و القای بیان ژن با IPTG 0/01 مولار شرایط کشت فرمانتوری به این ترتیب تغییر کرد: دما:23 درجه- pH:7.2-اکسیژن رسانی :0/9 بار-دور همزن:280rpm- دو خروجی هوا با flow 0/2 به مدت 12 ساعت انجام شد. نتایج نشان داد نوع محیط کشت مؤثرترین عامل است و محیط کشت پیچیده همراه با گلوکز l/g 6 به دلیل افزایش زیاد توده سلولی و در نتیجه تولید زیاد پروتئین محصول، مناسبترین محیط کشت شناخته شد. در نتیجه پس از بررسی صحت بیان ژنی و تولید پروتئین نوترکیب سم عقرب بصورت عملکردی و با توجه به آنالیز های بیوانفورماتیک ساختار سوم پروتئینی سم، پپتید سمی با نام nAnCra1 بعنوان یک نوروتوکسینα با قابلیت تاثیر بر کانال سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ معرفی گردید.
|
|
|
:
|
Scorpion venoms are a complex set of bioactive components that function by affecting ion channels as the most important target area. Dangerous scorpions have α-toxin with long chain peptides and four disulfide bridges effective on sodium channels.Based on the clinical and medical importance of A. crassicauda scorpion venom in Iran, in this study and in continuation of the previous study, after optimizing the genetic structure and also optimizing the expression of the AnCra1 toxic peptide gene, in the pET22b vector system with the susceptible E.Coli RG2 bacterial strain, the cloning process and recombinant gene expression was performed under improved conditions. In the continuation of the first project, after confirming the correctness of the genetic structure and its correct cloning in the receptive bacteria and confirming the transformed bacteria containing the gene encoding the newly synthesized toxin, cultivation in the conditions of the fermentor and its optimization was carried out: first, according to the conditions of the fermentor in Availability: volume, oxygenation conditions, pH characteristics, temperature, stirrer type and stirrer speed were optimized. Then, the selection of the bacterial strain with the maximum expression ability in the fermenter conditions: E.Coli RGb strains, according to its capabilities, and then the choice of the commercial and artificial laboratory bacterial culture medium was made, and at the end It was done by optimizing the conditions of gene expression in the fermenter according to the time, amount and type of inducer of gene expression. Finally, the best ship conditions in terms of CFU amount and optimization of bacterial cultivation in temperature conditions: 35.5 degrees - pH: 6.8 - oxygenation: 0.7 bar - stirring speed: 250 rpm - two air outlets with flow 0.2 - and a rate of 5% Excess glucose on LB broth culture medium (K2HPO4: 12.5g/l, KH2PO4: 2.3g/l, yeast extract: 20g/l, trypton 10g/l, ) for the culture of transformed bacteria E.Coli RG2 for 3 hours and then After reaching the OD of the medium to 0.8 and inducing gene expression with IPTG 0.01 M, the fermentation culture conditions were changed as follows: temperature: 23 degrees - pH: 7.2 - oxygenation: 0.9 bar - stirring speed: 280 rpm - two The air output was done with a flow of 0.2 for 12 hours.The results showed that the type of culture medium is the most effective factor and the complex culture medium with 6 l/g glucose was recognized as the most suitable culture medium due to the large increase in cell mass and as a result the high production of product protein. As a result, after checking the correctness of gene expression and production of recombinant protein of scorpion venom functionally and according to the bioinformatic analyzes of the third protein structure of the venom, the toxic peptide named nAnCra1 was introduced as a neurotoxin with the ability to affect the voltage-dependent gated sodium channel.
|
| |