|
" بهينه سازي بيان نوترکيب توکسين Ancra1 از عقرب آندروکتنوس کراسيکدا در شرايط آزمايشگاهي جهت افزايش بيان "
زارع ميرک آبادي، عباس
| شماره شناسایی
|
:
|
18886232
|
| شماره مدرک
|
:
|
۶۸۱۹۴
|
| نام عام مواد
|
:
|
[گزارش نهایی -عادی]
|
| شناسه افزوده
|
:
|
زارع ميرک آبادي، عباس
|
|
|
:
|
محمدپوردونيقي، ناصر
|
| عنوان اصلي
|
:
|
بهينه سازي بيان نوترکيب توکسين Ancra1 از عقرب آندروکتنوس کراسيکدا در شرايط آزمايشگاهي جهت افزايش بيان
|
| نام نخستين پديدآور
|
:
|
زارع ميرک آبادي، عباس
|
| عنوان اصلي به زبان ديگر
|
:
|
Optimization of recombinant toxin ( Ancra1) expression in laboratory scale to increase the yield
|
| وضعیت انتشار
|
:
|
کرج: موسسه تحقيقات واکسن وسرم سازي رازي، ۱۴۰۴
|
| فروست
|
:
|
شماره ثبت ۶۸۱۹۴ مورخ ۱۴۰۴/۰۸/۰۳۶۸۱۹۴
|
|
|
:
|
شماره طرح : 01-18-18-015-01018
|
|
|
:
|
سامانه سمپات
|
| توصیفگر
|
:
|
عقرب
|
|
|
:
|
Androctonus crassicauda
|
|
|
:
|
، نوروتوکسین
|
|
|
:
|
بیان ژن،
|
|
|
:
|
ساختار سوم پروتئین،
|
| خلاصه یا چکیده
|
:
|
سموم عقرب ها مجموعه ای پیچیده از اجزاء فعال زیستی است که با تاثیر بر کانالهای یونی به عنوان مهمترین ناحیه هدف، عملکرد دارند. عقرب های خطرناک دارای سم α با پپتیدهایی زنجیر بلند و چهار پل دی سولفیدی موثر بر کانالهای سدیم می باشند.
برمبنای اهمیت کلینیکی و پزشکی سم عقرب A. crassicauda در ایران در این مطالعه و در ادامه مطالعه پیشین جهت بهبودی سازه ژنی و نیز بهینه سازی بیان ژن پپتید توکسیک AnCra1، با آنالیز ژن و توالی اسیدآمینه ای توکسینAnCra1 شناسایی شده و بیان شده در سیستم PDB و بانک UniProt و بررسی بیوانفورماتیک و بهینه سازی توالی پپتید جهت بیان در باکتری E.Coli نسبت به انتخاب و طراحی و ساخت کانستراکت ژنی مناسب با ویژگی های بیانی قابل قبول (ایجاد سه جهش نقطه ای اختصاصی مکان و نیز اضافه شدن تگ های ویژه) در سیستم وکتوری pET22b (بجای pET32a) اقدام و با تهیه سویه باکتری پذیرا E.Coli RG2 (بجای E.Coli BL21) با قابلیت DE3 نسبت به فرایند کلونسازی و بیان ژن نوترکیب با شرایط بهبود یافته اقدام گردید. پس از اطمينان از كلونينگ موفق ژن nAnCra1 در پلاسميد، بيان پروتئين در آن کلون با آزمايش هاي SDS-PAGE و ايمونوبلات، مورد بررسي قرار گرفت. باكتري مجاور شده با IPTG در مقايسه با زمان پيش از افزودن IPTG حاوي پروتئين هایی جدید در محدوده 6.5-14.5 کیلودالتون (≈9 KD) بود كه با وزن مولكولي تئوری بیوانفورماتیکال قابل انتظار براي پروتئين همخواني داشت. در نتیجه پس از بررسی صحت بیان ژنی و تولید پروتئین نوترکیب سم عقرب بصورت عملکردی و با توجه به آنالیز های بیوانفورماتیک ساختار سوم پروتئینی سم، پپتید سمی با نام nAnCra1 بعنوان یک نوروتوکسینα با قابلیت تاثیر بر کانال سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ معرفی گردید.
در ادامه پس از تایید صحت سازه ژنی و کلون سازی صحیح آن در باکتری پذیرا و تایید باکتری ترانسفورم شده حاوی ژن کد کننده توکسین نو ترکیب نسبت به کشت در شرایط فرمانتور و بهینه سازی آن اقدام شد: ابتدا با توجه به شرایط فرمانتور در دسترس : حجم، شرایط اکسیژن دهی، ویژگیهای PH ، دما ، نوع همزن و دور همزن بهینه شد. سپس نسبت به انتخاب سویه باکتری با قابلیت بیان حداکثری در شرایط فرمانتور : باکتری E.Coli سویه های RGb, با توجه به قابلیتهای آن اقدام شد و در ادامه نسبت به انتخاب محیط کشت باکتری به صورت تجاری و دست ساز آزمایشگاهی اقدام شد و در انتها با بهینه سازی شرایط بیان ژن در فرمانتور به نسبت زمان ، میزان و نوع القاء کننده بیان ژن اقدام گردید. در نهایت بهترین شرایط کشتی از نظر میزان CFU و بهینه سازی کشت باکتری در شرایط دما:35.5 درجه- pH:6.8-اکسیژن رسانی :0/7 بار-دور همزن:250rpm- دو خروجی هوا با flow 0/2- و میزان 5درصد گلوکز اضافی بر محیط کشت LB براث (K2HPO4:12.5g/l, KH2PO4: 2.3g/l, yeast extract: 20g/l, trypton 10g/l, ) جهت کشت باکتری ترانسفورم شده E.Coli RG2 به مدت 3 ساعت و پس از رسیدن OD محیط به 0/8 و القای بیان ژن با IPTG 0/01 مولار شرایط کشت فرمانتوری به این ترتیب تغییر کرد: دما:23 درجه- pH:7.2-اکسیژن رسانی :0/9 بار-دور همزن:280rpm- دو خروجی هوا با flow 0/2 به مدت 12 ساعت انجام شد. نتایج نشان داد نوع محیط کشت مؤثرترین عامل است و محیط کشت پیچیده همراه با گلوکز l/g 6 به دلیل افزایش زیاد توده سلولی و در نتیجه تولید زیاد پروتئین محصول، مناسبترین محیط کشت شناخته شد. در نتیجه پس از بررسی صحت بیان ژنی و تولید پروتئین نوترکیب سم عقرب بصورت عملکردی و با توجه به آنالیز های بیوانفورماتیک ساختار سوم پروتئینی سم، پپتید سمی با نام nAnCra1 بعنوان یک نوروتوکسینα با قابلیت تاثیر بر کانال سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ معرفی گردید.
در ادامه پس از کشت باکتری ترانسفورم شده در سیستم فرمانتوری با حجم بالا و تعیین بهترین شرایط کشت؛ اقدام به خالص سازی پروتئین نوترکیب از باکتری در سیستم کروماتوگرافی تمایلی IMAC و تعیین روش موثر خالص سازی بواسطه رزین مناسب نیکل آگاروز (Ni-NTA) اقدام گردید. جداسازی باکتری از محیط کشت توسط سانتریفیوژ و تخریب پیکره باکتری توسط شرایط فیزیکی یا شیمیایی و سانترفیوژ جهت حذف پیکره باکتری و بارگذاری مایع رویی در سیستم IMAC با پروتوکل هیبرید بر روی رزین نیکل آگاروز و در نهایت تایید توکسین خالص توسط SDS-PAGE. نتایج نشان داد نوع محیط کشت مؤثرترین عامل است در نتیجه پس از بررسی صحت بیان ژنی و تولید پروتئین نوترکیب سم عقرب بصورت عملکردی و با توجه به آنالیز های بیوانفورماتیک ساختار سوم پروتئینی سم، پپتید سمی با نام nAnCra1 بعنوان یک نوروتوکسینα با قابلیت تاثیر بر کانال سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ معرفی گردید. در انتها باید گزارش کرد که بازده بیانی باکتری به ازای هر لیتر محیط کشت باکتری E.Coli RG2 میزان 05/0 میلی گرم پروتئین توکسین نوترکیب در سیستم ارلن آزمایشگاهی (حاوی بافل) و میزان 7/0 میلی گرم در سیستم فرمانتوری (با کنترل شرایط ویژه کشت) بدست آمد. که در مقایسه با مطالعه پیشین (005/0میلی گرم در لیتر) میزان 10 تا 120 برابر به ترتیب در ارلن و فرمانتور تولید پروتئین نوترکیب توکسین افزایش حاصل شده است و در نتیجه هدف اصلی طرح یعنی بهینه سازی بیان پروتئین نوترکیب حاصل شد. پس از استخراج و تخلیص پروتئین نوترکیب توکسین rAnCra1 به بررسی ویژگی های زیستی و فعالیت زیستی توکسین نوترکیب پرداخته شد. توکسین نوترکیب حاصله جهت انجام SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ و بررسی انجام MASS و فرایندهای MS2 و نیز تست Mascot ونیز فرایند های In-Vivo شامل تزریق به موش های NIH و بررسی پاسخ های فیزیولوژیک و نیز بررسی LD50 سم نوترکیب و در نهایت بررسی های الکترو فیزیولوژیکال سم نوترکیب حاصله مورد استفاده قرار گرفت. جرم مولکولی تجربی rAnCra2 حدود 8590.64 Da تعیین شده است که مربوط به طیفسنج جرمی MALDI TOF/TOF است. در ادامه آنالیز stereochemical پپتید rAnCra1 در نرم افزاز PROCHECK و رسم نمودار Ramachandran بیان داشت که با درجه 87.3 در این نمودار بر درستی قرار گیری ساختارهای دوم در جایگاه های مطمئن فضایی دلالت داشت. حداکثر پاسخ rAnCra1 بر روی کانالهای سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ 100nM مربوط به کانال NaV1.7 بود و هیچ تغییری در ولتاژ شروع فعالسازی و یا پتانسیل معکوس در هیچ یک از کانالهای سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ مورد بررسی در این مطالعه(NaV1.2, NaV1.5 ) مشاهده نشد. در کانال NaV1.7 آهسته شدن فرایند غیر فعالسازی در غلظت 100nM مشاهده شد. بنظر میرسد کانال NaV1.7 حساسترین کانال به rAnCra1 باشد.
در نتیجه بهینه سازی بیان ژنی و نیز بهینه سازی تولید پروتئین نوترکیب nAnCra1 بصورت عملکردی و با توجه به آنالیز های بیوانفورماتیک ساختار پروتئینی سم، بعنوان یک نوروتوکسینα با قابلیت تاثیر بر کانال سدیمی دریچه دار وابسته به ولتاژ بهمراه بازده تولیدی بیان پروتئین نوترکیب بالاتر و نیز عملکرد نوروتوکسینی قابل قبول معرفی گردید.
کلید واژه:
عقرب Androctonus crassicauda، نوروتوکسین، ساختار سوم پروتئین، بیان ژن، کانال سدیمی
|
|
|
:
|
Scorpion venoms are complex mixtures of bioactive compounds that primarily exert their effects by targeting ion channels. Dangerous scorpions typically contain α-toxins with long-chain peptides and four disulfide bridges that act on sodium channels. Due to the clinical and medical importance of Androctonus crassicauda venom in Iran, this study aimed to improve the gene construct and optimize the expression of the AnCra1 toxic peptide. Bioinformatic analyses of the AnCra1 gene and amino acid sequence were carried out using data from the PDB and UniProt databases. A gene construct containing three site-specific mutations and expression-enhancing tags was designed in pET22b (instead of pET32a). The recombinant gene was expressed in E. coli RG2 (DE3) under optimized cloning and expression conditions. After confirming successful cloning, protein expression was validated via SDS-PAGE and immunoblotting. Induction with IPTG produced novel proteins ranging from 6.5–14.5 kDa, consistent with the expected molecular weight (~9 kDa) of the target toxin. Following successful expression, fermenter-based optimization was performed, refining pH, temperature, oxygenation, stirring conditions, and carbon sources. The most efficient bacterial strain (E. coli RGb) and medium (complex LB + 6 g/L glucose) were identified, greatly improving cell growth and protein yield. The recombinant protein was then purified using Ni-NTA affinity chromatography (IMAC). Confirmation of purity was done via SDS-PAGE. Protein yield reached 0.05 mg/L in lab flasks and 0.7 mg/L in fermenters, showing a 10–120× improvement over previous studies.
Subsequent bioactivity assessments included Western blot, mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF), MS2 analysis, in vivo injections into NIH mice, LD₅₀ determination, and electrophysiological tests. The theoretical molecular mass was determined to be 8,590.64 Da, and stereochemical analysis via PROCHECK and Ramachandran plots confirmed proper folding (87.3% residues in favorable regions). Functional studies revealed that the recombinant neurotoxin rAnCra1 selectively modulated voltage-gated sodium channels, particularly NaV1.7, slowing down its inactivation process. No significant changes were seen on NaV1.2 or NaV1.5 channels.
Keyword:
Scorpion Androctonus crassicauda, neurotoxin, tertiary structure, gene expression, sodium channel
|
| |